在组织学、病理学与细胞生物学领域，固定（fixation）是指保存生物组织、防止其因自溶或腐败而降解的过程。固定终止任何正在进行的生化反应，并可能提高处理过的组织的机械强度或稳定性。组织固定是制备组织切片的关键步骤，其总体目标是保存细胞与组织成分，并使后续能够制备薄而可染色的切片。这样便可研究组织的结构，而组织结构由蛋白质与核酸等大分子在细胞内外的大小与形状决定。
固定剂通过凝固、形成加合化合物，或凝固与加合相结合的方式使蛋白质变性，从而发挥保护作用。一种能与大分子发生化学加合的化合物，若能同时结合两个不同大分子的部分，就最有效地稳定结构，这种作用称为交联。
进行组织固定有若干原因。原因之一是杀死组织，从而防止死后腐败（自溶与腐败）。[1]
固定使生物材料（组织或细胞）在制备检查样本的过程中尽可能接近自然状态。为此通常必须满足若干条件。
第一，固定剂通常使内源性生物分子失活，尤其是蛋白水解酶，否则它们会消化或损伤样本。
第二，固定剂通常保护样本免受外源性损伤。固定剂对组织中可能存在或可能定植于固定组织的多数常见微生物（尤其是细菌）有毒。此外，许多固定剂会化学改变固定材料，使其对机会性微生物而言更不可口（不可消化或有毒）。
最后，固定剂常在分子层面改变细胞或组织，以提高其机械强度或稳定性。这种增加的强度与刚性有助于在样本进一步处理时保存其形态（形状与结构）。
即使最仔细的固定也会改变样本并引入伪影，从而干扰对细胞超微结构的解释。一个著名例子是细菌的中间体（mesosome），它在 20 世纪 70 年代曾被认为是革兰阳性菌的细胞器，后来用为电镜开发的新技术证明它只是化学固定造成的伪影。[2][3]固定与其他组织处理程序的标准化会考虑这种伪影的引入，确定哪些程序会引入哪类伪影。了解每种组织类型与处理技术可能出现何种伪影的研究者，能够准确解释带伪影的切片，或选择在感兴趣区域尽量减少伪影的技术。
固定通常是制备显微或其他分析样本的多步流程中的第一步。因此，固定剂与固定方案的选择可能取决于后续处理步骤与最终分析。例如，免疫组化使用与特定蛋白靶点结合的抗体。长时间固定会化学遮蔽这些靶点，阻止抗体结合。在这些情况下，通常使用冷福尔马林约 24 小时的快速固定法。100% 甲醇也可用于快速固定，时间因生物材料而异。例如，MDA-MB 231 人乳腺癌细胞可用冷甲醇（−20 °C）仅固定 3 分钟。对于酶定位研究，组织应仅轻度预固定，或在酶活性产物形成后再后固定。
根据待固定样本的不同，固定过程通常分为三类。
热固定用于固定单细胞生物，最常见的是细菌与古菌。通常将生物体与水或生理盐水混合，以帮助样本均匀铺开。稀释后，将样本涂布到显微镜载玻片上。这种稀释的细菌样本放在载玻片上后通常称为涂片。涂片在室温干燥后，用镊子或衣夹夹住载玻片，在本生灯火焰上通过数次，以热杀死生物体并使其黏附于载玻片。也可使用微型焚烧器。加热后，样本通常进行染色，然后用显微镜成像。[4]热固定通常保存整体形态，但不保存内部结构。热使蛋白水解酶变性并防止自溶。热固定不能用于荚膜染色法，因为热固定会使荚膜（糖萼）收缩或破坏，染色时无法看到。[5]
浸泡可用于固定从单细胞到整个生物体的组织学样本。将组织样本浸入固定液一定时间。固定液体积必须至少为组织体积的 10 倍。[6]为使固定成功，固定剂必须扩散到整个组织，因此必须考虑组织大小与密度以及固定剂类型。这是细胞学应用的常用技术，也可用于较大组织。样本越大，浸泡时间越长，固定剂才能到达深部组织。[7]
灌注是使液体通过器官或生物体的血管或自然通道。在灌注固定中，固定剂被泵入循环系统，通常通过插入左心室的针头。这可在超声引导下进行，或通过打开受试者胸腔进行。[8]固定剂注入心脏，注入体积与典型心输出量匹配。利用固有的循环系统，固定剂分布到全身，组织在固定前不会死亡。使用该方法时，还必须在循环系统某处设置引流口，以容纳加入的固定剂与缓冲液体积，通常在右心房。固定剂被泵入循环系统，直到取代全部血液。灌注的优点是保存形态，[9]缺点是受试者死亡，且较大生物体所需固定剂体积高，可能增加成本。可通过夹闭供应非研究兴趣组织的动脉来减少灌注固定所需液体量。灌注固定常用于对大鼠脑、肺与肾组织成像，也用于人类尸检。[7][10]
在浸泡与灌注固定过程中，化学固定剂用于将结构保存于尽可能接近活组织的状态（化学与结构两方面）。这需要化学固定剂。
交联固定剂通过在组织蛋白质之间形成共价化学键发挥作用。这将可溶性蛋白锚定于细胞骨架，并赋予组织额外刚性。对于胚胎分化波期间的收缩等瞬态或精细细胞骨架结构，最好在加入交联固定剂前先用微波预处理。[11][12]
组织学中最常用的固定剂是甲醛。通常使用 10% 中性缓冲福尔马林（NBF），即约 3.7%–4.0% 甲醛的磷酸盐缓冲液，pH 7。由于甲醛在室温下是气体，配制时使用福尔马林，即甲醛气体溶于水（约 37% w/v）。甲醛通过交联蛋白质，主要是碱性氨基酸赖氨酸残基，来固定组织。其作用可被过量水逆转，并避免福尔马林色素沉着。多聚甲醛也常用，加热时会解聚回福尔马林，因而也是有效固定剂。多聚甲醛的优点包括可长期保存与良好的组织穿透性，尤其适合免疫组化技术。甲醛蒸气也可用于固定细胞涂片。
另一种常用醛类固定剂是戊二醛。它与甲醛作用相似，会使蛋白质 α 螺旋变形。但戊二醛分子比甲醛大，因此透过膜更慢；因此，对较厚组织样本的戊二醛固定可能困难，可通过缩小组织样本解决。戊二醛固定的优点之一是可提供更刚性或连接更紧密的固定产物，其更长分子与两个醛基使其能够桥接并连接更远的蛋白质分子对。它引起快速且不可逆的改变，非常适合电镜，在 4 °C 下工作良好，并能提供最佳的胞质与核细节。然而，它不适用于免疫组化染色。
一些固定方案要求甲醛与戊二醛联合使用，以互补各自优势。
这些交联固定剂，尤其是甲醛，倾向于保存蛋白质二级结构，也可能保存大部分三级结构。
沉淀（或变性）固定剂通过降低蛋白质溶解度、并常破坏赋予许多蛋白质三级结构的疏水相互作用来发挥作用。蛋白质的沉淀与聚集与醛类固定剂的交联是非常不同的过程。
最常见的沉淀固定剂是乙醇与甲醇，常用于固定冰冻切片与涂片。丙酮也使用，在丙酮-苯甲酸甲酯-二甲苯（AMEX）技术中，已显示比冰冻切片有更好的组织学保存。
使蛋白质变性的甲醇、乙醇与丙酮很少单独用于固定组织块，除非研究核酸。
乙酸是一种变性剂，有时与其他沉淀固定剂联合使用，如 Davidson 的 AFA。[13]醇类单独使用已知会在固定过程中引起组织明显收缩与硬化，而乙酸单独使用与组织肿胀相关；两者结合可能更好地保存组织形态。
氧化性固定剂可与蛋白质及其他生物分子的侧链反应，形成稳定组织结构的交联。但它们尽管保存精细细胞结构，却造成广泛变性，主要用作次级固定剂。
四氧化锇常在制备电镜样本时用作次级固定剂。它不用于光镜，因为对厚组织切片穿透很差。
重铬酸钾、铬酸与高锰酸钾都用于某些特定组织学制备。
B-5 与 Zenker 固定液等汞制剂机制未知，可增加染色亮度并提供极好的核细节。尽管快速，汞制剂穿透差并造成组织收缩。其最佳应用是固定造血与网状内皮组织。另需注意，由于含汞，处置时必须小心。
苦味酸盐穿透组织良好，与组蛋白及碱性蛋白反应，与氨基酸形成结晶性苦味酸盐，并沉淀所有蛋白质。它是结缔组织的良好固定剂，能很好保存糖原，并提取脂质，在生物胺与多肽激素的免疫染色中优于甲醛。但除非固定后彻底冲洗，否则会造成嗜碱性细胞丢失。
Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护效应（HOPE）可提供类似福尔马林的形态，极好保存免疫组化与酶组织化学所需的蛋白抗原，获得良好的 RNA 与 DNA 产量，且不产生蛋白交联。
固定作为独立的实验室步骤形成于 19 世纪。切片机与显微镜的改进使薄切片成为常规，病理学家需要在包埋前保存组织，固定因而从简单的保存手段发展为可标准化的技术。
福尔马林在 19 世纪 90 年代被引入作为固定剂，中性缓冲福尔马林随后成为标准，因为它减少福尔马林色素形成，并在形态与抗原保存之间取得较好平衡。
戊二醛在 20 世纪 60 年代被开发为电镜固定剂，其两个醛基可形成比甲醛更强的交联，因而能更好地保存超微结构。
20 世纪后期至 21 世纪初，HOPE 等非交联固定剂被开发出来，以改善核酸与抗原保存，并减少醛类固定带来的交联遮蔽。
此后，病理学会与标准化机构陆续发布固定指南，因为分析前变异仍是诊断误差的主要来源之一。
甲醛穿透快、成本低、兼容大多数染色，但交联会遮蔽抗原，且长期固定可使组织变脆。中性缓冲福尔马林是常规石蜡切片的首选。
戊二醛交联更强、保存超微结构更好，但穿透慢、组织收缩明显，主要用于电镜和小块组织。
醇类通过沉淀蛋白固定，穿透快，适合冰冻切片与涂片，但引起明显收缩与硬化，单独使用较少。
丙酮在 AMEX 技术中表现良好，适合某些冰冻切片，但对组织形态的保存不如醛类稳定。
乙酸常与醇类联合使用，以平衡醇类收缩与乙酸膨胀，Davidson AFA 是典型配方。
四氧化锇保存脂质与膜结构极佳，但穿透差、毒性高，只用作电镜的次级固定剂。
汞制剂提供极好的核细节，但穿透差、收缩明显且含汞，处置成本高，已逐渐被替代。
苦味酸盐对结缔组织与糖原保存良好，但会造成嗜碱性细胞丢失，需要充分冲洗。
在外科病理中，固定时间与固定液选择直接影响切缘判断、免疫组化与分子检测。乳腺、肺与淋巴结标本通常要求切开后充分固定，以避免中心固定不足。
在免疫组化中，过度交联会降低抗原可及性，必要时需进行抗原修复。修复方法包括加热、酶消化或强碱处理，但并非所有表位都能恢复。
在分子病理中，核酸完整性依赖固定方式。醇类固定和 HOPE 通常比长时间福尔马林固定保留更好的 RNA 质量，但石蜡包埋仍可能造成降解。
在法医病理中，固定用于保存组织供后续毒理与组织学检查，固定时间与温度会影响酒精、药物与代谢物的检测结果。
在动物实验中，灌注固定是保存脑、肺与肾等器官形态的标准方法，但灌注压力与流速必须控制，以避免血管破裂或组织水肿。
甲醛是已知致癌物与呼吸道刺激物，配制与操作应在通风橱中进行，并佩戴手套与护目镜。许多实验室已改用封闭式自动组织处理机以减少暴露。
戊二醛是强刺激物与致敏物，可引起职业性哮喘与皮炎，使用时应避免皮肤接触与蒸气吸入。
四氧化锇具有强毒性与挥发性，必须在通风橱中操作，废液按重金属废物处理。
汞制剂含汞，废弃组织与废液属于危险废物，需要专门回收，许多国家已限制其使用。
苦味酸干燥时有爆炸风险，应保持湿润并按危险化学品管理。
分析前变量包括离体时间、固定延迟、固定液种类、固定时长、组织厚度与温度，这些变量会影响免疫组化、原位杂交与测序结果。
美国临床病理学会与皇家病理学院等机构发布了固定指南，但不同指南在最小固定时间与切片厚度上并不完全一致。
抗原修复可以部分逆转甲醛交联，但修复过度会造成组织脱落或抗原丢失，修复不足则染色微弱，因此需要按抗体与组织类型优化。
固定伪影的识别仍是形态学诊断的一部分。中间体、空泡、收缩与色素沉着都可能被误认为病变，研究者需要结合固定方案解释图像。
替代固定剂的研究仍在进行，目标是在不使用甲醛的情况下同时保存形态、抗原与核酸，但迄今尚无一种替代品能完全满足所有下游分析。
组织离体后应尽快固定，延迟固定会引起自溶，尤其影响胰腺、胃肠道与脑组织。离体时间、固定起始时间与固定结束时间应记录在标本申请单上，以便追溯。
固定液体积通常要求至少为组织体积的十倍，标本应切开或修整到合适厚度，使固定液在合理时间内渗透到中心。致密组织如子宫、淋巴结与骨组织需要更长时间或更小尺寸。
固定温度影响交联速度。室温固定便于常规操作，4 °C 固定可减少自溶但速度较慢，加热固定可加速交联但可能损伤抗原。
固定后的组织应充分冲洗，以去除多余固定液，避免后续染色背景过深或福尔马林色素沉着。
质量保证包括定期更换固定液、监测 pH、记录批号与浓度，并用对照组织验证固定效果。实验室还应保存固定时间与处理程序的审计记录。
在冰冻切片中，固定通常在切片后进行，固定液与时间需要根据抗原与染色方案优化。冰冻切片的形态不如石蜡切片稳定，但对快速诊断与敏感抗原更有价值。
在电镜标本中，固定液渗透压、pH 与缓冲液组成都会影响超微结构，通常采用戊二醛预固定、四氧化锇后固定，并通过梯度脱水与树脂包埋保存结构。
在免疫组化中，固定不足会导致抗原弥散，固定过度会导致表位遮蔽，因此需要针对每种抗体确定最佳固定时间。
在原位杂交中，固定不足会使核酸降解，固定过度会使探针难以穿透。HOPE 与醇类固定常用于需要保留核酸的标本。
在数字病理与人工智能应用中，固定与染色的一致性直接影响图像特征的可重复性，因此标准化比单一最佳方案更重要。
固定不足的标本中心可出现自溶、空泡与细胞核模糊，切片时易碎裂，染色呈淡染或背景高。
固定过度的标本质地变硬、切片易卷曲，免疫组化染色减弱，核酸提取质量下降。
福尔马林色素是酸性甲醛与血液成分反应形成的棕色颗粒，可通过碱性醇洗脱或使用中性缓冲福尔马林预防。
组织收缩在醇类固定与脱水过程中最明显，可引起测量偏差，因此形态测量研究应报告固定与处理方案。
固定质量直接影响病理诊断的可靠性。固定不足的标本可能出现细胞核染色质模糊、胞质空泡化和组织结构崩解，导致无法区分坏死、自溶与真正的病变。
固定过度则使组织过度硬化，切片时容易产生撕裂和卷曲，细胞核染色变淡，免疫组化信号减弱。病理医生在阅片时需要结合固定记录判断这些改变。
在肿瘤诊断中，固定延迟与固定不足会影响肿瘤分级、切缘评估和淋巴管侵犯的判断。对于需要分子检测的标本，固定时间过长还会降低 DNA 与 RNA 的可用性。
在移植病理中，固定方式影响对缺血再灌注损伤、排斥反应和感染的识别。活检标本通常较小，固定时间相对容易控制，但仍需避免干燥。
在尸检中，组织自溶程度取决于死亡至固定的间隔、环境温度与组织类型，固定方案应据此调整，不能简单套用外科活检流程。
固定剂选择取决于组织类型、后续染色、分子检测与时间限制。常规石蜡切片通常首选中性缓冲福尔马林，因为它兼顾形态、成本与兼容性。
需要保存超微结构时，应使用戊二醛或甲醛-戊二醛混合固定，并在低温下操作，以减慢自溶并提高膜结构保存。
需要快速诊断时，冰冻切片配合醇类或丙酮固定更合适，但形态与抗原保存可能不如醛类稳定。
需要保存核酸时，应避免长时间醛类固定，可选用醇类、HOPE 或其他非交联固定剂，并尽快进入核酸提取流程。
需要保存脂质与膜结构时，四氧化锇是电镜的首选后固定剂，但其毒性与穿透限制要求组织块足够小。
在资源有限的环境中，固定剂的可获得性、稳定性与处置成本也会影响选择，因此指南通常提供多种可接受方案。
人体组织固定涉及知情同意、隐私与标本管理。固定后的组织仍属于人体材料，其使用、储存与销毁应符合伦理与法律要求。
甲醛的职业暴露限值在各国不同，长期低浓度暴露仍可能引起刺激与致敏。实验室应监测空气浓度，并提供局部排风与个人防护。
甲醛废液与固定过的组织属于特殊废物，不能直接排入下水道，需要按当地法规收集与处置。
戊二醛与四氧化锇同样需要专门处置，含汞固定剂的废弃组织应按危险废物管理。
减少固定剂用量的方法包括缩小组织块、使用封闭式处理机与回收系统，但这些措施需要在形态与安全之间取得平衡。
替代固定剂的研究目标是在不使用醛类的情况下保存形态、抗原与核酸，目前已有多种候选，但尚无一种能完全替代福尔马林。
自动化与封闭式组织处理可减少人为变异与职业暴露，但设备成本与维护要求限制了普及。
数字病理与人工智能需要高度一致的固定与染色，因此固定标准化可能成为算法可重复性的前提。
单细胞与空间组学对固定提出了新要求，因为既要保存分子信息，又要保留空间位置，现有固定剂往往难以同时满足。
固定研究的一个长期问题是缺乏跨实验室的统一参考物质，这使得不同固定方案的比较仍然困难。
固定不仅保存形态，也决定染色结果。醛类固定保留蛋白质的氨基，有利于伊红染色，但可能掩盖某些抗原表位，使免疫组化信号减弱。
醇类固定使蛋白质沉淀，核酸保存较好，但细胞收缩明显，核染色可能过深，胞质细节不如醛类固定。
苦味酸与汞制剂可增强某些结构的对比，但会改变组织化学成分，因此不适合后续分子检测。
氧化性固定剂可保存脂质与膜结构，但广泛变性使许多抗原失活，通常只用于电镜或特殊染色。
固定液的 pH 与渗透压也会影响染色。低渗固定液可引起细胞肿胀，高渗固定液可引起细胞皱缩，二者都会改变形态测量结果。
甲醛交联会碎片化 DNA 与 RNA，并遮蔽核酸序列，因此长时间固定的标本在测序与 PCR 中可能表现不佳。
醇类固定与 HOPE 可更好地保存核酸，但组织形态与石蜡包埋的兼容性需要验证。
在临床分子检测中，实验室应记录固定时间与固定液类型，并将这些变量纳入结果解释。对于需要高灵敏度检测的标本，固定延迟可能比固定剂本身更关键。
固定不足还会导致蛋白酶未被灭活，核酸在提取前继续降解，因此固定与保存是一个连续流程，不能只看单一环节。
骨与钙化组织在固定后通常需要脱钙才能切片，脱钙液的选择会影响抗原与核酸保存。强酸脱钙快速但破坏抗原，EDTA 脱钙温和但耗时。
脂肪组织固定后仍难以切片，因为脂质在脱水过程中被溶解，留下空隙。脂肪丰富的标本需要更长的固定时间与更仔细的修整。
淋巴结固定需要切开或穿刺，因为被膜阻碍固定液渗透。固定不足的淋巴结中心可出现自溶，影响转移灶判断。
脑组织富含脂质且质地柔软，固定时间通常较长，灌注固定可显著改善深部结构的保存。
肌肉与心肌在固定后容易收缩，使用等渗固定液与轻度预固定可减少收缩伪影。
冰冻切片不经过脱水与包埋，固定通常在切片后进行，因此固定液必须快速渗透且不破坏抗原。
醇类与丙酮是冰冻切片常用的固定剂，但会引起细胞收缩，形态不如醛类固定稳定。
冰冻切片固定时间过长会使组织干燥，过短则抗原弥散，操作者需要根据组织与染色方案调整。
在术中快速诊断中，固定与染色时间被压缩到数分钟，固定不足与冰晶形成是主要的形态学限制。
固定后的标本应储存在密封容器中，并标明固定液类型与固定起始时间。运输过程中应避免干燥、冻结与剧烈震动，因为冰晶会破坏细胞结构。
长期储存的标本可能因固定液蒸发而干燥，也可能因酸性固定液而继续硬化，因此需要定期检查容器与液面。
在转诊会诊中，固定质量决定了远程病理诊断的可靠性。固定不足或过度固定的标本在运输后往往更难补救，因此固定记录应随标本一起转送。
在病理教学中，固定良好的标本能清楚展示组织结构与病变关系，固定不足的标本则容易让学生把自溶误认为坏死，因此教学标本的固定质量尤其重要。
固定也是病理技术培训的核心内容。技术人员需要理解固定剂的作用机制、渗透规律与常见伪影，才能在面对不同组织与临床需求时作出合理选择。
固定方案的选择最终是一个权衡：病理医生希望形态清晰，分子实验室希望核酸完整，免疫组化希望抗原可及，而实验室管理者还要考虑成本、安全与周转时间。理解这些相互冲突的目标，是合理使用固定剂的前提。
固定不是孤立的步骤，而是组织处理链条中的第一环，其质量会在切片、染色、诊断与分子检测中被逐级放大。